图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗*基因（tetr)和氨苄青霉素抗*基因（a...

问题详情：

图1是某基因工程中构建重组质粒的过程示意图，载体质粒P0具有四环素抗*基因（tetr)和氨苄青霉素抗*基因（ampr）。请回答下列问题：

（1）EcoRV酶切位点为，EcoR V酶切出来的线*载体P1为___________末端。

（2）用TaqDNA聚合酶进行PCR扩增获得的目的基因片段，其两端各自带有一个腺嘌呤脱氧核苷*。载体P1用酶处理，在两端各添加了一个碱基为___________的脱氧核苷*，形成P2；P2和目的基因片段在__________酶作用下，形成重组质粒P3。

（3）为筛选出含有重组质粒P3的菌落，采用含有不同抗生素的平板进行筛选，得到A、B、C三类菌落，其生长情况如下表（“+”代表生长，“﹣”代表不生长）。根据表中结果判断，应选择的菌落是__________（填表中字母）类，另外两类菌落质粒导入情况分别是_____、________________。

（4）为鉴定筛选出的菌落中是否含有正确*入目的基因的重组质粒，拟设计引物进行PCR鉴定。图2所示为*、乙、*3条引物在正确重组质粒中的相应位置，PCR鉴定时应选择的一对引物是__________。某学生尝试用图中另外一对引物从某一菌落的质粒中扩增出了400bp片段，原因是_______________。

【回答】

平    胸腺嘧啶（T）    DNA连接    B    A类菌落含有P0    C类菌落未转入质粒    乙*    目的基因反向连接   

【解析】

【分析】

基因表达载体的基本结构包括复制原点、目的基因、标记基因、启动子、终止子等。根据题干信息和图形分析，P0是载体质粒，其含有的氨苄青霉素抗*基因（ampr）和四环素抗*基因（tetr）都属于标记基因，可用于检测目的基因是否导入受体细胞；EcoRV酶为限制酶，其切割质粒后会破坏四环素抗*基因（tetr）。

【详解】

（1）根据题意分析，EcoRV酶识别的序列是-GATATC-，并且两条链都在中间的T与A之间进行切割，因此其切出来的线*载体P1为平末端。

（2）依题意并据图分析，目的基因两侧为黏*末端，且露出的碱基为A，则在载体P1的两端需要各加一个含有碱基T的脱氧核苷*，以便形成具有黏*末端的载体P2，再用DNA连接酶将P2与目的基因连接起来形成重组质粒P3。

（3）根据以上分析已知，限制酶（EcoRV酶）切割后破坏了四环素抗*基因，但是没有破坏氨苄青霉素抗*基因，因此含有重组质粒P3的菌落在含有四环素的培养基中应该不能生长，而在含有氨苄青霉素的培养基中能生长，结合表格分析可知，应该选择B类菌落。根据表格分析，A类菌落在氨苄青霉素和四环素的培养基中都能够生长，说明其导入的是P0；C类菌落在任何抗生素的培养基中都不能生长，说明其没有导入任何质粒。

（4）据图分析，根据目的基因*入的位置和PCR技术的原理分析，PCR鉴定时应该选择的一对引物是乙和*；根据题意和图形分析，某同学用图中的另外一对引物（*、乙）从某一菌落的质粒中扩增出了400bp的片段，说明其目的基因发生了反向连接。

【点睛】

解答本题的关键是识记并理解基因工程的四个基本步骤，尤其是对核心步骤——构建基因表达载体步骤的理解，明确基因表达载体的几个必须的成分及其作用，进而结合题干要求分析答题。

知识点：基因工程

题型：填空题