乳糖酶是一种生物酶制剂，主要用来治疗乳糖不耐受症。研究人员利用基因工程技术，将人工优化的米曲霉乳糖酶基因（la...

问题详情：

乳糖酶是一种生物酶制剂，主要用来治疗乳糖不耐受症。研究人员利用基因工程技术，将人工优化的米曲霉乳糖酶基因（lacA）导入乳*克鲁维酵母细胞，获得了高效表达乳糖酶的重组菌株。下图1为载体PKLACl的限制酶切图谱（总长度为9091bp，bp表示碱基对；XhoⅠ、BglⅡ、SacⅡ表示限制酶，数字代表碱基的编号），amdS基因编码的乙酰*酶能够将乙酰*降解成氨，只有转化成功的乳*克鲁维酵母才能在乙酰*作为唯一氮源的培养基中生长。图2为含有lacA的DNA片段。

请回答下列问题：

（1）米曲霉合成并分泌至胞外的乳糖酶能将乳糖分解为________。

（2）优化后的米曲霉乳糖酶基因片段lacA中G-C碱基含量由原来的51.4%降低到39.2%，使乳*克鲁维酵母偏爱的密码子出现的频率大幅度增加，从而在不改变乳糖酶________序列的前提下，提高了重组菌株该基因表达中________（填具体步骤）的效率。

（3）将优化的米曲霉乳糖酶基因片段lacA与pKLACl分别使用用XhoⅠ、BelⅡ双酶切，然后用________连接,得到含目的基因的重组质粒（pKLAC1—lacA，长度为12040bp）。若目的基因置换了pKLACl中一段长33bp的片段，则目的基因的长度为________bp.

（4）用小剂量质粒提取试剂盒提取重组质粒，对所提取的重组质粒用SacⅡ单酶切后纯化，纯化产物用1%琼脂凝胶进行电泳检测。若结果如图3中的第________（填序号）泳道所示，则说明优化后的目的基因片段lacA成功构建在质粒pKLACl中。

（5）将重组质粒pKLACl-lacA用SacⅡ单酶切使其线*化，纯化后与感受态乳*克鲁维酵母细胞混合、转化。用________适当稀释细胞液，均匀地涂布于________平板上进行培养，富集并筛选重组菌株。将筛选出的重组菌株进行发酵培养120h，检测________，最终获得高效表达乳糖酶的重组菌株。

【回答】

葡萄糖和半乳糖    氨基*    翻译    DNA连接酶    2982    1、3    无菌水    以乙酰*作为唯一氮源    乳糖酶活*/活力   

【解析】

基因工程技术的基本步骤： （1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。 （2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。 （3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样，将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因*法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注*法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。 （4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染*体的DNA是否*入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术，个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活*鉴定等。

【详解】

（1）乳糖由葡萄糖和半乳糖组成，故乳糖酶能将乳糖分解为葡萄糖和半乳糖。

（2）乳糖酶的化学本质是蛋白质，优化后的米曲霉乳糖酶基因片段lacA中G-C碱基含量由原来的51.4%降低到39.2%，使乳*克鲁维酵母偏爱的密码子出现的频率大幅度增加，从而在不改变乳糖酶氨基*序列的前提下，提高了重组菌株该基因表达中翻译的效率。

（3）乳糖酶基因片段lacA与pKLACl分别使用XhoⅠ、BelⅡ限制*酶酶切，然后用DNA连接酶连接，得到含目的基因的重组质粒。题干信息可知，载体PKLACl的限制酶切图谱总长度为9091bp，含目的基因的重组质粒（pKLAC1—lacA，长度为12040bp）。若目的基因置换了pKLACl中一段长33bp的片段，则目的基因的长度为12040909133=2982bp。

（4）重组质粒，用SacⅡ单酶切后，形成两个大小不同的DNA片段，结合图3，M是marker组，1、2、3号是酶切组，对比分析结果第1、3泳道所示，说明优化后的目的基因片段lacA成功构建在质粒pKLACl中。

（5）防止污染用无菌水适当稀释细胞液，均匀地涂布于以乙酰*作为唯一氮源平板上进行培养，富集并筛选重组菌株。将筛选出的重组菌株进行发酵培养120h，检测乳糖酶活*/活力，最终获得高效表达乳糖酶的重组菌株。

【点睛】

本题考查基因工程的相关知识，要求考生识记基因工程的原理及*作步骤，掌握基因工程各*作步骤的相关细节，能结合所学的知识准确答题，属于考纲识记和理解层次的考查。

知识点：基因工程

题型：综合题