問題詳情:
大引物PCR定點突變常用來研究蛋白質結構改變導致的功能變化。單核苷*的定點誘變僅需進行2輪PCR反應即可獲得,第一輪加誘變引物和側翼引物,第一輪產物作第二輪PCR擴增的大引物,過程如圖所示。請分析回答下列問題:
(1) 引物結合到互補DNA鏈時的温度稱退火温度,常規PCR設定的退火温度通常是____。為了使兩輪PCR反應在同一支試管中進行,引物設計時應考慮不同的退火温度,第二輪PCR的退火温度應該比第一輪____,第二輪PCR仍需加入的引物是____。
(2) PCR擴增的定點誘變產物通常需要連接到載體分子上才能表達出相應的*狀,該定點誘變產物需具備____等結構才能進行轉錄和翻譯。新發現UGA(終止密碼子)可以對應一種新的氨基*,下圖是已轉錄出的mRNA部分鹼基序列,預測虛線框後的第一個密碼子最多有____種。
(3) 欲將某功能蛋白的第17位Cys(UGU)改造成Ser(UCU),應將誘變引物設計包含____序列,該過程屬於____技術範疇。
【回答】
55-60℃ 高 (另一種)側翼引物 啟動子和終止子 14 –AGA-或-TCT- 蛋白質工程
【分析】
PCR技術:
概念:PCR全稱為聚合酶鏈式反應,是一項在生物體外複製特定DNA的核*合成技術。
原理:DNA複製。
前提條件:要有一段已知目的基因的核苷*序以便合成一對引物。
條件:模板DNA、四種去氧核苷*、一對引物、熱穩定DNA聚合酶(Taq酶)。
過程:①高温變*:DNA解旋過程;②低温復*:引物結合到互補鏈DNA上;③中温延伸:合成子鏈。
PCR擴增中雙鏈DNA解開不需要解旋酶,高温條件下*鍵可自動解開
【詳解】
(1)PCR中退火的温度要求為55-60℃;第二輪PCR會在同一支試管裏以第一輪的產物作為擴增引物,因此退火温度需要設置的更高,以防止第一輪的引物結合到DNA上;第二輪PCR仍然需要加入另一種側翼引物,以便進行另一條鏈的延伸。
(2)若要使得目的基因可以表達出蛋白質,則需要在產物上具備啟動子和終止子,誘導基因轉錄;每三個相鄰的鹼基決定一個氨基*,被稱為一個密碼子,AUG是起始密碼子,因此圖中虛線框後的字母U是一個密碼子的第一個鹼基,由題意可知該位置不能不對應氨基*,不對應氨基*的終止密碼子本來有3種,現在UGA(終止密碼子)可以對應一種新的氨基*,因此可能的密碼子有4×4-3+1=14種。
(3)由於Ser的密碼子為UCU,因此再設計PCR引物(本質為DNA)時,需要包含–AGA-(作為模板鏈)或-TCT-(作為非模板鏈),該項技術屬於蛋白質工程。
【點睛】
本題的難點是結合PCR的原理和過程推斷大引物PCR定點突變的大致原理和過程,易錯點是對所給虛線框後鹼基構成密碼子種類的考察,識記密碼子的種類和終止密碼子的數目,及對該題中編碼氨基*的要求進行合適的分析是該易錯點的解題方法。
知識點:DNA和蛋白質技術
題型:綜合題